醋酸质量对CE-MS测定蛋白质肽图谱图质量的影响

【核心介绍】考察醋酸质量对CE-MS结果的影响。方法：在使用不同级别的醋酸条件下，进口高质量分析纯和LC-MS级别醋酸，采用CE-MS分析蛋白质质量肽图。结论：本文对比了进口高质量分析纯醋酸和LC-MS级别醋酸在CE-MS分析蛋白质肽图时的影响。在空白实验中，LC-MS级醋酸的TIE波动程度约为分析纯醋酸的一半；对比谱图基线发现，采用LC-MS级别醋酸在m/z=400处基线高度仅为基峰的5%，但是如果采用分析纯醋酸，该处基线高度可达基峰的20%，基线噪音提高4倍；在BSA实验组中，分析纯醋酸组灵敏度为采用LC-MS级 　

醋酸质量对CE-MS测定蛋白质肽图谱图质量的影响

李晓，徐延昭*

（中国食品药品检定研究院，北京100050）

摘要目的：考察醋酸质量对CE-MS结果的影响。方法：在使用不同级别的醋酸条件下，进口高质量分析纯和LC-MS级别醋酸，采用CE-MS分析蛋白质质量肽图。结论：本文对比了进口高质量分析纯醋酸和LC-MS级别醋酸在CE-MS分析蛋白质肽图时的影响。在空白实验中，LC-MS级醋酸的TIE波动程度约为分析纯醋酸的一半；对比谱图基线发现，采用LC-MS级别醋酸在m/z=400处基线高度仅为基峰的5%，但是如果采用分析纯醋酸，该处基线高度可达基峰的20%，基线噪音提高4倍；在BSA实验组中，分析纯醋酸组灵敏度为采用LC-MS级别醋酸的1/2-1/3。因此，LC-MS级试剂是毛细管电泳质谱联用技术的首选。

关键词毛细管电泳质谱联用；醋酸质量；灵敏度

中图分类号O657.63

Effect of Acetic Acid Quality for Determination of Protein Peptide Mapping by Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry

Li Xiao, Xu Yanzhao *

(National Institutes for Food and Drug Control, Beijing 100050, China)

Abstract Objective: Studying the effect of acetic acid quality of CE-MS results. Methods: Under the condition of the use of different levels of acetic acid, high quality analytically pure level and LC-MS level acetic acid were imported, the protein peptide mapping was analyzed by CE-MS. Conclusion: In this article, we compared the influence of the imported high quality analytically pure level and LC-MS level acetic acid in the CE-MS analysis protein peptide mapping. In blank experiment, TIE volatility of LC-MS level acetic acid is about half of the analytically pure acetic acid. Comparingthe chromatogram baseline, the LC-MS level of acetic acid in the m/z=400 baseline height was only about 5% of the base peak, but if pure acetic acid is analyzed,  the baseline height can be up to 20% of the base peak, four times baseline noise increases. In the BSA experimental group, the sensitivity of the analytically pure group was 1/2-1/3 of the LC - MS group.So LC - MS level reagent is the first selection of CE-MS technology.

Key words: Capillary electrophoresis-mass spectrometry: The quality of acetic acid; Sensitivity

质谱是目前药物分析中最强的分析和鉴定手段之一，极高的灵敏度和对牛血清有较强的抗干扰能力，使其得到了广泛的应用。目前液相色谱（LC）是分析人员最常用的质谱前分离手段，无论是化学药还是生物药的检测中，液相色谱质谱联用（LC-MS）都有着十分广泛的应用^[1-4]。毛细管电泳是一种高效的分离分析模式，在药物检测领域有着越来越广泛的应用，多个基于毛细管电泳的方法已经被收入各个药典中^[5-7]。由于分离原理不同，将毛细管电泳作为与质谱联用的前分离手段，可以解决很多LC-MS不易解决的问题，并可以提供不同分离原理的正交验证数据。

目前重组蛋白质药物是生物医药领域最热门的产品。产生了很多十分重要的药物。因此无论是仿制药还是原研药，重组蛋白质药物的研究都如火如荼的进行着。由于蛋白质药物的复杂性，其对表征手段要求也远高于普通化学药物^[8-10]。对蛋白质药物肽图的表征是确定其序列和翻译后修饰的主要手段。常规情况下，研究人员均通过LC-MS方法进行肽图分析^[11-14]。而毛细管电泳质谱联用（CE-MS）可以提供一种依据肽段的电荷质量比分离的正交于LC-MS的分离手段。同时由于CE采用空毛细管进行分离，因此在肽图分析过程中基本无残留。此外，由于翻译后修饰肽段所带电荷通常不同于未修饰肽段，因此CE-MS十分适合分析蛋白质药物的翻译后修饰和序列变异^[15-16]。

目前CE-MS常用的分析条件是采用低于10%的醋酸作为分析缓冲液。由于对试剂质量重要性的认识不足，实验人员通常倾向于选择进口分析纯试剂，认为其标称纯度与LC-MS近似但价格相对便宜，是高性价比选择。据作者所知，截至目前为止，并没有人考察过醋酸质量对CE-MS结果的影响。

本文考察了进口的分析纯醋酸和LC-MS级醋酸对CE-MS空白和分析蛋白质肽图时的影响。实验结果表明，由于使用的CE-MS接口灵敏度提高，即使是使用进口分析纯醋酸，仍会带来一定的干扰，其灵敏度为采用LC-MS级醋酸的1/2-1/3。因此建议选用LC-MS级醋酸，以确保高质量的实验结果，尤其是在检测低含量的翻译后修饰肽段过程中使用LC-MS级醋酸是十分重要。

1 材料与方法

1.1 样品

牛血清白蛋白购自Sigma公司

1.2 主要仪器及试剂

本文所有实验均采用ECE-001型毛细管电泳仪（CMP Scientific, Corp. ），质谱为thermofisher公司orbitrap XL型高分辨质谱仪。联用接口采用CE-MS离子源: EMASS-II型毛细管电泳与电喷雾质谱联用离子源 (CMP Scientific, Corp.)。实验用毛细管为CMP公司CE-MS专用毛细管，外径360微米，内经50微米，内壁未经涂层，在毛细管出口端采用特殊方式进行了刻蚀，使外径缩小到150微米左右，从而保证质谱接口处可以达到零死体积，最大程度上保证毛细管电泳的高分辨率不受影响。

本文所用水和醋酸均购自sigma Aldrich，其中水为LC-MS级别，醋酸分为LC-MS和分析纯两个级别。BSA酶解产物标准品由CMP公司提供。

1.3 方法

毛细管电泳质谱联用检测条件：实验以5%醋酸为分离缓冲液，鞘液采用加入0.5%甲酸的10%甲醇水溶液。毛细管长度50厘米，分离电压20 kV。实验均采用压力进样，0.3 psi，7s。电喷雾电压1.8 kV，由离子源自带电源提供。

2 结果

由于毛细管电泳质谱联用系统所需试剂量较小，且早期接口灵敏度较差，因此实验人员往往对试剂质量不够重视。采用醋酸等试剂时多用分析纯试剂，而未见不良反应报道。但是由于目前新型CE-MS接口纷纷问世，灵敏度有两至三个数量级的提升^[17-19]，因此试剂中的微量杂质影响开始越来越显著的体现出来。

首先对采用不同醋酸的空白实验结果进行考察。首先考察了LC-MS级醋酸和分析纯醋酸对CE-MS空白实验总离子流图（TIE）的影响，如图1所示，两种醋酸的TIE谱图强度相似，也都比较平稳。但更细致的观察时发现：采用LC-MS级醋酸的TIE波动程度约为分析纯醋酸的一半，说明在此条件下接口喷雾更稳定，更能得到好的实验结果。

图1 采用不同纯度醋酸的CE-MS总离子流图（TIE）。上图是采用LC-MS级醋酸的TIE图，下图是采用分析纯醋酸的TIE图。

接下来进一步考察了两种醋酸的CE-MS空白质谱图，结果如图2所示。我们选取了0-7 min范围内质谱做平均，谱图中基峰均是m/z=371的离子，峰高度均在5e4左右，主要离子m/z=371和m/z=445等相应强度也相似。但是，当对比谱图基线时发现，采用LC-MS级别醋酸在m/z=400处基线高度仅为基峰的5%，但是如果采用分析纯醋酸，该处基线高度可达基峰的20%，基线噪音提高4倍，将对灵敏度造成显著影响。同时由于离子源的离子化效率限制，基线变高还会影响待测离子的离子化效率，从而进一步影响检测灵敏度。

图2 采用不同纯度醋酸的空白质谱图。

上图是采用LC-MS级醋酸的结果，下图是采用分析纯醋酸的结果。

为了进一步验证上述结果，接下来用两种醋酸进行了BSA酶解产物标准品的肽谱分析，如图3所示。从基峰电泳图（BPE）中可以看出，出峰比较靠前的6-12.5 min出峰时间基本相同，但是12.5-17 min处峰强度明显降低，峰形状也有所变化。说明采用分析纯醋酸会影响部分肽段的检测灵敏度。

图3，采用不同纯度醋酸时CE-MS分析牛血清白蛋白酶解产物肽谱。上图是采用LC-MS级醋酸的结果，下图是采用分析纯醋酸的结果

接下来选取了三个不同出峰时间的多肽进一步验证不同醋酸的影响。肽段的序列和带电状态等信息见表1。三个多肽的出峰时间分别为8.46 min，14.29 min和17.48min，前两个峰的情况见图4。其中8.46 min的峰面积差别不大。说明对出峰前段的多肽的信号影响并不是很大。当观察出峰时间在14.29 min的多肽则出现了比较大的差别，采用分析纯醋酸的峰面积仅为使用LC-MS级的峰面积的37.6%。而对于出峰时间在17.48的多肽，由于其强度较低，重新提取了一张谱图，见图5。采用LC-MS级醋酸时峰面积是采用分析纯醋酸的2.5倍。从以上结果可以看出，无论对高含量组分还是低含量组分，醋酸纯度对峰面积均有较大的影响，选用高纯度醋酸对CE-MS实验，尤其是定量实验至关重要。

表1，三种牛血清白蛋白肽段CE-MS结果。

序列	质核比（m/z）	电荷	迁移时间	峰面积（LCMS级醋酸）	峰面积（分析纯醋酸）
KVPQVSTPTLVEVSR	547.32	3	8.46	1.35E8	1.40E8
IKQNCDQF	1052.40	1	14.29	4.81E7	1.81E7
VDKCCAADDKEACFAVEGPK	1135.03	2	17.48	6.24E6	2.46E6

图4，肽段KVPQVSTPTLVEVSR（m/z=547.32）和IKQNCDQF(m/z=1052.40)的提取离子电泳图。上图是采用LC-MS级醋酸的结果，下图是采用分析纯醋酸的结果

图5，肽段VDKCCAADDKEACFAVEGPK（m/z1135.03）的提取离子电泳图。

上图是采用LC-MS级醋酸的结果，下图是采用分析纯醋酸的结果

3 讨论

首次考察了不同纯度级别的醋酸对CE-MS实验结果的影响。结论表明，虽然同样是进口高纯度试剂，LC-MS级的醋酸比分析纯的醋酸可以提供更高的灵敏度，更稳定的电喷雾，从而帮助实验人员得到更好实验结果。

参考文献

[1] 关瑾, 许文雅, 阎峰,等. 液相色谱-质谱联用技术在药物代谢组学研究中的应用进展[J]. 药物分析杂志, 2016(1): 9-16.

[2] 张齐家, 孙文军. 串联质谱及液质联用技术在药物分析研究中的应用[J]. 中医药学报, 2009, 37(6): 23-29.

[3] SCHIEL JE, AU J, HE HJ. LC-MS/MS biopharmaceutical glycoanalysis: identification of desirable reference material characteristics.[J]. Anal Bioanal Chem, 2012, 403(8):2279-89.

[4] HOPFGARTNER G, LESUR A, VARESIO E. Analysis of biopharmaceutical proteins in biological matrices by LC-MS/MS II. LC-MS/MS analysis[J]. Trac Trends in Analytical Chemistry, 2013, 48(1):52-61.

[5] QI Y, LI Y, BAO JJ. Development of a CE method analyzing ADA and PNP and its application in inhibitor screening[J]. Anal Biochem. 2016 2697(16): 30064-71.

[6] XU Z, YE F, WANG Y, et al. Pressure-assisted electrokinetic injection stacking for citalopram drug to achieve highly sensitive detection and enantioseparation by capillary electrophoresis[J]. Se Pu. 2015, 33(9):988-94.

[7] FU X, XIAO H, LIANG S, et al. A method developed to fractionate intact proteins based on capillary electrophoresi[J]. Analyst. 2016, 141(1):305-10.

[8] FEDERICI M, LUBINIECKI A, MANIKWAR P, et al. Analytical lessons learned from selected therapeutic protein drug comparability studies[J]. Biologicals, 2013, 41(3):131-147.

[9] ZHANG Z, PAN H, CHEN X. Mass spectrometry for structural characterization of therapeutic antibodies[J]. Mass Spectrometry Reviews, 2009, 28(1):147-76.

[10] BECK A, WAGNER-ROUSSET E, AYOUB D, et al. Characterization of therapeutic antibodies and related products[J]. Analytical Chemistry, 2012, 85(2):715-36.

[11] ZHANG J, QIN T, XU L, et al. Development and Validation of a Peptide Mapping Method for the Characterization of Adalimumab with QDaDetector[J]. Chromatographia, 2016:1-9.

[12] WANG Y, LI H, SHAMEEM M, et al. Development of a sample preparation method for monitoring correct disulfide linkages of monoclonal antibodies by liquid chromatography–mass spectrometry[J]. Analytical Biochemistry, 2016, 495:21-28.

[13] BonGERS J, CUMMINGS J M, FEDERICI M, et al. Validation of a peptide mapping method for a therapeutic monoclonal antibody: what could we possibly learn about a method we have run 100 times[J]. Journal of Pharmaceutical & Biomedical Analysis, 2000, 21(6):1099-1128.

[14] DICK L W, MAHON D, QIU D, et al. Peptide mapping of therapeutic monoclonal antibodies: Improvements for increased speed and fewer artifacts[J]. Journal of Chromatography B, 2009, 877(3):230-236.

[15] LEW C, GALLEGOS-PEREZ JL, FonSLOW B, et al. Rapid level-3 characterization of therapeutic antibodies by capillary electrophoresis electrospray ionization mass spectrometry[J]. J Chromatogr Sci. 2015, 53(3):443-9..

[16] WANG Y, LI H, SHAMEEM M, et al. V Development of a sample preparation method for monitoring correct disulfide linkages of monoclonal antibodies by liquid chromatography-mass spectrometry[J]. Anal Biochem. 2016 , 495(1):21-8.

[17] RAMAUTAR R, HEEMSKERK AM, HENSBERGEN P J, et al. CE–MS for proteomics: Advances in interface development and application[J]. Journal of Proteomics, 2012, 75(13):3814-28.

[18] DOVICHI N, WOJCIK R. SHEATH-FLOW ELECTROSPRAY INTERFACE: US, US20130140180[P]. 2013.

[19] YAN X, SUN L. Bottom-up proteome analysis of E. coli, using capillary zone electrophoresis-tandem mass spectrometry with an electrokinetic sheath-flow electrospray interface[J]. Proteomics, 2013, 13(17):2546-51.