核磁共振内标法测定松果菊苷对照品的含量
核磁共振内标法测定松果菊苷对照品的含量
席兴军 初侨 杨丽
摘要 本文建立了用核磁共振内标法快速、准确地测定松果菊苷对照品含量的方法。采用Bruker公司400 MHz核磁共振仪，在氘代DMSO为溶剂、苯甲酸为内标、25℃条件下采集松果菊苷和苯甲酸混合物的核磁共振氢谱。以松果菊苷中化学位移在δ 6.22和苯甲酸中化学位移在δ7.95的质子信号峰为定量峰，其峰面积比与其质量比的线性回归方程为=0.014X+0.115，相关系数r=0.9980，测得3批松果菊苷的质量分数分别为99.42%，99.34%和99.31%。结果表明，在没有对照品的情况下，核磁共振内标法可用于松果菊苷对照品的含量测定和质量控制，同时也能够为其他化学对照品的含量测定提供参考。
关键词 核磁共振；含量测定；松果菊苷
中图分类号 O482.53+2
Determination of Echinacoside with 1H-NMR Spectroscopy
Xi Xingjun,Chu Qiao,Yang Li
（China National Institute of Standardization,Beijing,100088）
Abstract This article established a rapid and accurate method for the determination of echinacoside with 1H-NMR spectroscopy. We acquired 1H-NMR spectra of the mixture of echinacoside and benzoic acid at 25℃ with Bruker 400 MHz spectrometer, deuterated DMSO as solution, benzoic acid as internal standard. The integration of proton signals at δ 6.22 of echinacoside and δ 7.95 of benzoic acid could be used for the quantification. Linear regression of quantitative peak areas ratio of echinacoside - benzoic acid versus mass ratio yielded a correlation coefficient of 0.9970 and regression equation of y=0.197x+0.783. We determined the content of 3 batches of echinacoside was 99.42%, 99.34% and 99.31% respectively. The results showed that the concentrations of echinacoside determined by quantitative nuclear magnetic resonance were slightly lower than that by HPLC without reference substance, and this method can be used for the content determination and quality control of echinacoside, as well as providing references for content determination of other reference substances.
Key words QNMR;Determination;Echinacoside
松果菊苷（Echinacoside，ECH），为苯乙醇苷类（Phenylethanoid glycoside，PhG）化合物，是名贵药材肉苁蓉的主要活性成分之一，也是评价该产品质量的重要指标[1]。植物化学研究表明，很多抗衰老中药中均含有松果菊苷或其他苯乙醇苷类化合物，而该类化合物被认为是这些中药的主要抗衰老成分，因此，ECH已成为研究的热点化合物之一。近年来研究表明，ECH具有较强的抗氧化、神经保护作用，有抗衰老、提高记忆力，调控细胞凋亡等功效[2]，此外还具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗肿瘤、保护肝脏、提高免疫力的作用[3]。目前对其含量的测定与分析方法主要有紫外分光光度法、比色法（硝酸铝比色法、重氮盐比色法）和高效液相色谱法。紫外分光光度法的实验条件比较容易达到，但是其样品前处理的操作步骤比较繁琐；硝酸铝比色法是利用松果菊苷结构中的邻二羟基进行显色反应，但其他非苯乙醇苷类的邻二羟基物质也会对测定产生干扰[4]。高效液相色谱法灵敏度高，受干扰小，样品处理也比较简单，适于成分复杂样品的检测分析。以上方法虽然可以测定样品中的松果菊苷含量，但在测定方法中均需要高度依赖对照品。
定量核磁共振（Quantitative nuclear magnetic resonance，QNMR）技术作为一种日益成熟的仪器分析方法，具有色谱法、光谱法等含量测定方法不可比拟的优势，样品预处理步骤简单、测定快速准确、专属性强、不破坏样品等，现已在化学、食品、农业及军事等领域得到了较广泛的应用[5]。其中，检测过程不依赖对照品是该方法的一大优势。近几年，QNMR技术在天然产物领域的应用也越来越广泛，已经涵盖了新药研发的多个环节，包括药品质量控制、候选药物纯度测定及药物体内代谢物研究等。而且随着高磁场核磁共振仪及超低温探头的出现, 使对低含量化合物的定量测定具备了可行性，并且对于那些尚无对照品的创新药物的定量以及对照品的标定工作, 可考虑将QNMR作为首选的分析方法[6]，美、英等国家和其他地区的药典已经将核磁共振定量法规定为部分药物含量测定的标准测定方法[7-9]，但是有关采用此方法进行松果菊苷含量测定的研究尚未见报道。本研究采用核磁共振内标法对松果菊苷对照品的含量进行测定，以期建立在没有对照品的情况下松果菊苷的含量测定和质量控制方法，并为其他化学对照品含量的测定方法提供参考。
1 实验部分
1.1 仪器
Bruker 400 MHz超导核磁共振波谱仪。
1.2 试剂
氘代DMSO（美国CIL公司，氘代度＞99.9%），苯甲酸（美国Sigma公司，批号101253928，纯度99.2%），松果菊苷对照品。松果菊苷和苯甲酸的结构见图1。
图1 松果菊苷和苯甲酸的化学结构式
Fig.1 Chemical structure of Echinacoside and benzoic acid
1.3 实验条件
测定温度：25℃，FT size：131072，谱宽：15000.9Hz，环境湿度：35%，观察频率：400MHz，采集时间：3s，累加次数：32。
1.4 实验方法
根据文献报道，分别精密称取适量的松果菊苷对照品和苯甲酸对照品，置于直径5mm的核磁共振样品管中，加适量氘代DMSO试剂震荡溶解，制成待测试样溶液。在上述实验条件下调整仪器参数，匀场、采样，得到图谱后再进行相位和基线调整，对松果菊苷和苯甲酸的定量峰分别进行积分，按照1H-NMR内标法根据积分结果用以下公式计算样品的质量分数。
上述公式中，As：被测样品定量峰的积分面积，ns：被测样品定量峰包含的质子数，Ms：被测样品的分子质量，Ar：内标物质定量峰的积分面积，nr：内标物质定量峰包含的质子数，Mr：内标物质的分子质量，mr：称取的内标质量，Wr：内标的质量分数，ms：样品的质量。
2 结果与讨论
2.1 溶剂、内标和定量特征峰的选择
测试溶剂应选择对被测样品和内标物均具有很好溶解性且不造成干扰的氘代试剂。本研究选择氘代DMSO为测试溶剂，该溶剂对松果菊苷和苯甲酸的溶解性都良好，且核磁共振氢谱上溶剂峰在δ 2.49，对其他信号峰无干扰，不会影响含量测定结果。选择苯甲酸为内标物，从苯甲酸的核磁共振氢谱中可以看到苯甲酸的2位和6位质子信号在δ 7.95，与其他信号完全分开。因此，可作为该分析的内标物。
在定量分析之前，先通过核磁共振一维谱和二维谱对目标化合物的信号进行全归属分析。从松果菊苷的核磁共振氢谱图谱上可以看到，b′位的质子信号化学位移在δ 6.22，与其他信号完全分开。因此，该信号可作为定量分析的特征峰。核磁共振氢谱法测定松果菊苷含量的图谱见图2。
图2 核磁共振氢谱法测定松果菊苷含量的图谱
Fig.2 1H-NMR spectrum of Echinacoside determination
2.2 线性关系
按1.4的实验方法制备6个不同浓度的样品溶液，测定1H-NMR谱，分别对松果菊苷和苯甲酸特征信号峰的峰面积进行积分，每个样品的积分面积取3次积分的平均值，结果见表1。
表1 松果菊苷和苯甲酸的质量及峰面积积分值
Tab.1 Mass and integral value of peak area of Echinacoside and benzoic acid
|
样品号 |
Ms/mg |
mr/mg |
As |
|
1 |
9.0 |
5.2 |
0.1278 |
|
2 |
10.2 |
5.7 |
0.1450 |
|
3 |
11.3 |
5.5 |
0.1616 |
|
4 |
12.1 |
5.6 |
0.1729 |
|
5 |
13.0 |
5.7 |
0.1868 |
|
6 |
14.2 |
5.4 |
0.2019 |
注：Ms：松果菊苷质量；mr：苯甲酸的质量；As：松果菊苷峰面积积分值。
以松果菊苷和苯甲酸的积分面积比值Y对松果菊苷和苯甲酸质量比值X做线性关系图，得回归方程为Y=0.014X+0.115，相关系数r=0.9980。结果表明，采用核磁共振内标法对松果菊苷的含量进行测定，线性关系良好，达到含量分析的要求。
2.3 重复性实验
取2.2的2号样品，在上述同一实验条件下重复测定6次，以松果菊苷和苯甲酸定量特征峰的积分面积比值计算，检测重复性，RSD值为0.52%，结果表明，此方法重复性良好。
2.4 稳定性实验
取2.2的2号样品，室温下放置，按1.4的实验方法，分别于0、4、6、8、10 h后测定，检测稳定性，RSD值为0.46%，实验结果表明，样品溶液在10h内稳定。
2.5 加样回收率实验
分别取6份已知含量的松果菊苷样品约5mg，精密称定，分别加入高、中、低3个浓度的松果菊苷标准品，按1.4的实验方法测定1H-NMR谱，按回收率（%）=[测得含量-样品含量]/标准品添加，计算回收率，所得结果见表2。
表2 加样回收率实验（n=6）
Tab.2 Experiment of average recovery rate (n=6)
|
样品含量/mg |
加入量/mg |
测得量/mg |
回收率/% |
平均回收率/% |
|
10.2 |
3.1 |
13.3 |
100.04 |
99.12 |
|
10.4 |
3.4 |
13.8 |
100.01 |
|
|
10.2 |
5.3 |
15.4 |
98.09 |
|
|
10.6 |
5.0 |
15.5 |
98.01 |
|
|
10.0 |
7.5 |
17.5 |
100.02 |
|
|
10.1 |
7.0 |
17.0 |
98.57 |
2.6 样品测定
按照上述实验条件和方法，测定3批松果菊苷对照品和苯甲酸特征峰的峰面积，根据1.4的计算公式计算出松果菊苷对照品的绝对质量分数，同时采用高效液相色谱（HPLC）法对此3批松果菊苷对照品的相对质量分数进行测定，结果见表3。由表3中可以看到，三个批号的产品通过核磁定量检测，其纯度范围为99.31%-99.42%，高效液相色谱法测定范围为99.44%-99.51%，同批次高效液相色谱法比核磁共振波谱法含量测定结果高0.09%-0.16%。因此，采用核磁共振波谱法测得松果菊苷对照品的质量分数略低于HPLC峰面积归一化法。
表3 3批松果菊苷对照品含量测定结果(质量分数/%)
Tab.3 Determination result of the content of 3 batches of Echinacoside
|
样品批号 |
NMR法测定结果 |
HPLC法测定结果 |
|
130601 |
99.42 |
99.51 |
|
130602 |
99.34 |
99.44 |
|
130603 |
99.31 |
99.47 |
2.7 扫描次数的选择
将扫描次数设定为4、8、16、32、64、128，对样品分别进行实验。结果表明，扫描次数越多，信号信噪比越好，但是扫描次数的改变对样品和内标物积分面积的比值没有明显的影响，因此选择扫描次数为32。
3 结语
《国家中长期科学和技术发展规划纲要（2006-2020年）》明确把实施技术标准战略作为我国科技发展的重要战略之一，要求“研究制定高精确度和高稳定性的计量基标准”。因此，标准物质的研究与制备是我国的一项长期性、基础性工作。同时，随着我国经济的快速增长和贸易量的日益扩大，在名贵中药和高附加值的天然产物相关产品的质量评价过程中，对高纯度标准物质的需求也越来越大，要求也越来越高。对照品的研制可以定位为标准物质研制的重要阶段，其含量测定方法研究是标准物质定值的重要基础，直接决定后期标准物质的精确度。
本文采用核磁共振波谱法对松果菊苷对照品进行含量测定，其线性关系、重复性和稳定性均良好。方法具有样品量小、高效、简便等优点，含量测定和结构鉴定同步完成，同时解决定值过程中对该物质标准物质的依赖。该方法为天然产物标准物质的研制提供了有效的技术支持，也可以用于其它标准物质的含量测定。
参考文献
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