厉害了! 超高效液相色谱串联质谱法测定大气颗粒物中脱水单糖

【核心介绍】本文通过对大气颗粒物样品前处理方法进行筛选，色谱及质谱条件进行摸索与优化，建立了大气颗粒物中3种脱水单糖的超高效液相色谱-串联质谱分析方法。该方法不用衍生反应，操作简单，分析快速，左旋葡聚糖、甘露聚糖及半乳聚糖的加标回收率大于80%，相对标准偏差小于15%，方法检测限能够满足大气颗粒物中脱水单糖的检测分析要求,适于大量样品的分析监测。使用超高效液相色谱-串联质谱分析大气颗粒物中的左旋葡聚糖及其异构体在我国属首例报道，该方法开创了环境中该类物质分析的新局面，对后续的监测管理工作提供了有力的技术支持，同时也为 　

1 实验部分

1. 1 试剂与仪器

Acquity UPLC超高效液相色谱仪(Waters，美国)，XEVO-TQS micro^#QEA0053三重四极杆质谱仪 (Waters，美国)，TDZ5-WS多管架自动平衡离心机（湘仪离心机厂）；氮气蒸发仪（N-EVAP^TM111,美国 Organomation Associates Inc.）

甲醇、二氯甲烷、正己烷和乙腈(色谱纯，美国J T Baker公司)，标准品左旋葡聚糖（levoglucosan）、甘露聚糖(mannosan)、半乳聚糖(glactosan)（百灵威化学技术有限公司）, GHP过滤膜（Waters公司）。

1. 2 实验过程

1.2.1标准溶液的配制

取左旋葡聚糖、甘露聚糖及半乳聚糖固体，配成浓度为1000μg/mL的甲醇储备液，再逐级稀释成1.0，5.0，10、50、100、500、1000ng/mL的混合标准溶液。

1. 2.2 样品采集与制备

2013年及2014年在北京市部分地区使用大流量采样器采集的大气颗粒物样品，滤膜为石英材质，采样流速1.13m³/min，采样时间24h，滤膜面积50.24cm²。为了去除干扰，滤膜在采样前，于马弗炉中550℃加热6h以上，空白滤膜经实验测定不含有目标化合物。

1. 2.3 样品前处理

截取1.0cm²颗粒物样品加入2.0mL甲醇超声萃取两次，离心分离后，在氮气环境中浓缩至1.0mL，经0.22μm滤膜过滤，进行仪器分析。

1. 2.4 仪器条件

超高效液相色谱条件采用ACQUITY UPLC BEH Amide C₁₈色谱柱(100mm×2.1 mm，1.7μm，Waters公司), 流动相：乙腈溶液（A）和水溶液（B），流速：0.3mL/min，柱温：30℃，进样体积：1.0μL。梯度洗脱程序为：0～1.0min，95%A；1.0～2.5min，95%～90%A；2.5～3.0min，90%～50%A；3.0～4.0min，50%A；4.0～5.0min，50%～90%A；5.0～7.0min，95%A。

质谱条件 离子源：电喷雾离子源(electron spray ionization，简称ESI)，电离方式： ESI;扫描方式：负离子；监测方式：多反应监测(multiple reaction monitoring，简称MRM)模式；毛细管电压：2．54kV；离子源温度：150℃；脱溶剂温度：400℃；脱溶剂气流量：900L／h；锥孔气流量：30 L／h。在样品测试前，使用标准溶液校正质量轴。

2 结果与讨论

2.1萃取条件的选择

2.1.1萃取溶剂的选择

选取同一大气颗粒物样品，加入甲醇、正己烷、二氯甲烷、乙腈及水等溶剂，进行萃取，考察上述溶剂对大气颗粒物样品的萃取效果，结果如下。

图1不同溶剂对3 种MAs 的萃取效率

如图1 所示，甲醇、二氯甲烷、正己烷等溶剂均可萃取颗粒物样品中左旋葡聚糖及其异构体，但使用甲醇时，3种脱水单糖萃取效率较高，另外，甲醇与流动相互溶性很好，故选取甲醇做萃取溶剂。

2.1.2萃取溶剂体积的选择

选取相同的只含有左旋葡聚糖的大气颗粒物样品（另两种异构体类似），比较加入甲醇体积为1.0mL,2.0mL,3.0mL,4.0mL及5.0mL的萃取情况。

图 2不同体积甲醇对颗粒物中左旋葡聚糖的萃取

萃取溶剂使用过少（如1.0mL），溶液易饱和，滤膜上的MAs萃取不完全；溶剂用量过多，溶液过稀，必须浓缩很高倍数，才能达到仪器检测限。实验结果表明：2.0mL溶剂可以较完全地萃取颗粒物中的3种脱水单糖，同时样品经浓缩后（1.0mL）的浓度在定量分析范围之内，因此选取萃取溶剂体积2.0mL进行实验。

2.1.3超声萃取次数及时间

实验选取只含有左旋葡聚糖的颗粒物样品，考察了超声10min,15min,20min及30min的萃取效果，比较了一次和两次、三次超声的效率，结果如图3及图4所示。

图 3超声时间对萃取效果的影响

图 4超声次数对萃取效果的影响

超声时间的实验表明，随着从10min超声延长至15min超声，萃取量增加幅度很大，之后，时间增加，萃取量增加很少，甚至有所降低。因此选择15min超声。

超声次数的实验结果表明：随着超声次数的增加，萃取量增大，但溶剂体积过大，浓缩损失增加，两次超声效果最好。因此选择超声两次、每次15min萃取，回收率实验表明这种萃取可以满足大气颗粒物中脱水单糖——左旋葡聚糖、甘露聚糖及半乳聚糖的分析要求（详见表3）。

2.2色谱柱的选择

左旋葡聚糖及其异构体具有一定极性，易溶于水，可以选取反相色谱柱及氨基柱进行分离。本研究比较了几种商品化反相色谱柱（Symmetry C₁₈ 、Eclipse XDB-C₁₈、XTerra C₁₈、Xbridge C₁₈、Atlantis C₁₈、Hypersil ODS柱）对3种MAs的分离情况。结果表明：上述色谱柱不能将左旋葡聚糖从甘露聚糖及半乳聚糖中分开，且目标化合物基本上没有保留。大气颗粒物源解析通常关注左旋葡聚糖，如果它不能与其他异构体较好分离，很难做到准确定量。国外仅有几个人实现了左旋葡聚糖与其它异构体的分离，该问题一直制约着液相色谱-质谱分析方法的发展。十几年来，效果最好报道的是使用两根Atlantis dC₁₈色谱柱串联，配以高分辨飞行时间质谱（TOFMS）对溶解在四氢呋喃水溶液中的三种异构体进行定量。三种异构体在色谱柱死体积附近出峰，分离效果不很理想，而且为增加灵敏度使用的四氢呋喃对质谱分析的安全构成威胁。本实验采用BEH Amide C₁₈色谱柱，该柱与水兼容，在乙腈、水做流动相时将左旋葡聚糖与另两个异构体较好地分开，虽然甘露聚糖与半乳聚糖没有分开，但使用特征离子也可以定量，并且左旋葡聚糖可以准确定量，优于前期报道。

2.3质谱条件的选择

2.3.1离子源及电离模式的选取

根据文献调研，左旋葡聚糖及其异构体分子量较大，难挥发，ESI-MS模式下易离子化，失去一个H，在负离子谱图上出现[M-1]峰，测定灵敏度较高^[20-22]。本研究考察了电喷雾离子源ESI的正、负离子检测模式（ESI⁺及ESI^-）及大气压化学离子源（atmospheric pressure chemical ionization ，简称APCI）检测模式下3种单糖的分析情况。使用ESI⁺及APCI时，测定灵敏度均不如ESI^-，实验选取ESI^-模式电离，无须使用酸、碱及缓冲盐等增加灵敏度，三种MAs的检测限就可达ppb级，而且长期运行不会影响仪器的使用寿命。

2.3.2特征离子的选取

用针泵直接进样，经过对锥孔电压和碰撞电压等因素的优化，确定了3种MAs的质谱分析参数，列于表1。

表1 3种 MAs MS/MS 参数

分析物	母离子(m/z)	子离子(m/z)	锥孔电压（V）	碰撞电压（V）
左旋葡聚糖	160.97	100.92*/70.92	20	8 /10
甘露聚糖	161.03	84.97*/54.90	20	10/10
半乳聚糖	161.03	58.94*/86.99	20	18/14

*为定量离子

本研究分析每种化合物使用一个母离子及两个子离子，一个数据获得4个识别点，该方法获得数据符合EU2002/657/EC指令规定，可以满足监测要求。

2.4方法确证

2.4.1线性范围及检出限

取1.2.1配制的混合标准溶液，以目标组分的响应值y对相应的质量浓度x(ng/mL)绘制标准曲线，并以3倍信噪比计算方法的检出限（Limit of Detection,简称LOD），列于表2。

表2  3 种MAs的线性方程、相关系数及检测限表

分析物	线性方程	r2	检测限（ng/mL）
左旋葡聚糖	y=1.4583x-6.0998	0.9986	2
甘露聚糖	y=6.1461x-20.351	0.9941	3
半乳聚糖	y=5.19055x-20.344	0.9913	3

表2表明， 在给定的浓度范围内，3种MAs的线性关系良好，检出限可以满足大气颗粒物中左旋葡聚糖、甘露聚糖及半乳聚糖的分析要求。

2.4.2回收率与精密度

向大气颗粒物样品中添加两种浓度水平的3种MAs混合标准溶液，制成低浓度及高浓度的加标样品，按照上述方法进行前处理，每个浓度水平平行操作6次，计算回收率及相对标准偏差（Relative Standard Deviation,简称RSD），结果列于表3中。

表3   3 MAs的回收率及标准偏差（N=6）

化合物	加标/C
	10ng/mL		100ng/mL
	回收率(%)	相对标准偏差(%)	回收率(%)	相对标准偏差(%)
左旋葡聚糖	82.8	10.30	92.2	6.40
甘露聚糖	80.5	6.19	88.7	4.04
半乳聚糖	89.4	5.61	91.2	9.33

表3说明：大气颗粒物中3种单糖两种浓度加标回收率均大于80%，六个平行样品的相对标准偏差小于15%，方法准确度及精密度符合有机分析要求。

2.5实际样品的测定

使用上述方法，对北京城区采集的大气颗粒物样品进行分析，结果如表4。

表 4 大气颗粒物中3种 MAs分析结果ng/m³

样品编号	左旋葡聚糖	甘露聚糖	半乳聚糖
样品1	386	ND	ND
样品2	256.7	ND	ND
样品3	112.60	ND	ND
样品4	514.0	ND	ND

*ND即未检出

由表4可见：北京城区环境的大气颗粒物样品可以检测三种MAs，以左旋葡聚糖为主。 GC/MS检测体现出同样特征，所建方法满足科学研究及监测管理需求。

3  结论

本文通过对大气颗粒物样品前处理方法进行筛选，色谱及质谱条件进行摸索与优化，建立了大气颗粒物中3种脱水单糖的超高效液相色谱-串联质谱分析方法。该方法不用衍生反应，操作简单，分析快速，左旋葡聚糖、甘露聚糖及半乳聚糖的加标回收率大于80%，相对标准偏差小于15%，方法检测限能够满足大气颗粒物中脱水单糖的检测分析要求,适于大量样品的分析监测。使用超高效液相色谱-串联质谱分析大气颗粒物中的左旋葡聚糖及其异构体在我国属首例报道，该方法开创了环境中该类物质分析的新局面，对后续的监测管理工作提供了有力的技术支持，同时也为大气颗粒物中其它糖类物质的分析提供了依据与参考。

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